Обучался в 1837—1850 годах (с перерывом 1838—1840) в Академии роскошных искусств во Флоренции у живописцев и преподавателей Энрико Полластрини, Томмазо Газарини, Пьетро Бенвенути и Джузеппе Беззуоли.
В 1854 получил стипендию на продолжение обучения в Риме и в течение пары лет работал над крупномасштабными историческими полотнами, которые принесли ему фуррор и репутацию профессионального живописца.
В период с 1843 по 1849 гг. живописец был награжден 3-мя премиями флорентийской академии.
В декабре 1860 Стефано Усси был доктором флорентийской Академии роскошных искусств. С 1875 — членом Шведской царской академией искусств.
На Глобальной выставке в Париже в 1867 г. за картину: «Изгнание Вальтера Бриеннского, барона Афинского, из Флоренции» Стефано Усси была присуждена одна из восьми огромных наград, как наилучшему представителю тогдашней исторической живописи в Италии.
С.Усси создавал, в главном, реалистически четкие исторические полотна и портреты.
На его творчество оказали воздействие работы Ипполита Делароша и Доменико Морелли.
В 1869 Стефано Усси сделал поездку в Египет, после этого заинтересовался восточными темами и сделал ряд «ориентальных» картин.